From AK Prof. K. T. Wanner




Forschungsthemen

Mit einem Anteil von ca. 70% an den inhibitorischen Neuronen ist γ-Aminobuttersäure (GABA) der wichtigste inhibitorische Neurotransmitter des Zentralnervensystems (ZNS). Für eine Reihe neurologischer Erkrankungen wie Epilepsie, Huntington’s Chorea und Morbus Parkinson wird ein Zusammenhang mit einer pathologisch reduzierten GABA-Neurotransmission angenommen.

Die extrazelluläre Konzentration der γ-Aminobuttersäure (GABA) wird im Gehirn durch spezifische Transportproteine, die sogenannten GABA-Transporter, reguliert. Von diesen wurden bisher vier verschiedene Subtypen, mGAT1-mGAT4 (Bezeichnung bei der Maus), identifiziert.

Diese Subtypen unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Dichte in den verschiedenen Gehirnregionen, dem Zelltyp auf dem sie bevorzugt lokalisiert sind, wie auch in ihrer subzellulären Verteilung. So wird angenommen, dass die einzelnen GABA-Transporter-Subtypen auch unterschiedliche Funktionen wahrnehmen.

Nachdem mGAT1 und mGAT4 vor allem im Bereich des synaptischen Spalts vorkommen, nimmt man an, dass sie direkt in die synaptische Signaltransmission involviert sind und vorrangig die Aufgabe haben, GABAerge Signale durch Wiederaufnahme von ausgeschüttetem GABA zu terminieren. mGAT2 und mGAT3 treten dagegen nicht in den Synapsen, sondern an davon weiter entfernt liegenden Stellen auf. Zudem findet man diese Transporter auch auf einigen speziellen Zellstrukturen. Deshalb wird vermutet, dass sich die Funktionen dieser Transporter darauf beziehen, den „crosstalk“ zwischen den Synapsen zu kontrollieren, einen „spillover“ des Neutoransmitters zu verhindern und den allgemeinen „GABA-Status“ im Gehirn zu regulieren.

Ziel unserer Untersuchungen ist es, neue subtypenselektive Inhibitoren der GABA-Transporter zu entwickeln, die einen tieferen Einblick in die physiologischen Funktionen der einzelnen GAT-Proteine erlauben, die dazu beitragen das therapeutische Potenzial der einzelnen GAT-Subtypen auszuloten und die langfristig womöglich zu neuen Arzneistoffen führen.

In unserer Forschungsgruppe werden u.a. auch enantiomerenreine Verbindungen, Stickstoffheterocyclen und Aminosäurederivate, auf ihr Potenzial als Inhibitoren der GABA-Transportproteine untersucht. Deshalb beschäftigen wir uns intensiv mit der Entwicklung allgemein anwendbarer, asymmetrischer Syntheseverfahren zur Darstellung dieser Verbindungsklassen. Die biologische Evaluierung der erhaltenen Substanzen erfolgt durch Radioligand-Bindungsstudien.

Darüber hinaus kommen auch MS-Bindungsstudien zum Einsatz. MS-Bindungsstudien stellen ein von uns neu entwickeltes Verfahren dar, die nach einem den Radioligand-Bindungsstudien vergleichbaren Prinzip durchgeführt werden und von vergleichbarer Leistungsfähigkeit sind. Der besondere Vorteil der MS-Bindungsstudien ist in dem Umstand zu sehen, dass sie ohne Radioaktivität auskommen. Denn anstelle von Radioliganden werden bei MS-Bindungsstudien native Marker verwendet, die massenspektrometrisch quantifiziert werden.

Aus den Ergebnissen der biologischen Prüfungen werden Struktur-Wirkungs-Beziehungen und 3D-Bindungsmodelle erstellt, die als Basis für weitere Optimierungen dienen (Molecular Modeling).



MS-Bindungs-Assays

Die Charakterisierung von Testsubstanzen hinsichtlich ihrer Affinität definierten Targets gegenüber gehört zu den grundlegenden Aufgaben im Bereich der Arzneistoffentwicklung. Traditionell werden zur Affinitätsbestimmung von Testsubstanzen Bindungsassays durchgeführt, die auf dem Einsatz von radioaktiv- oder fluoreszenzmarkierter Liganden beruhen. Das Prinzip der Markierung von Liganden bringt jedoch verschiedene schwerwiegende Nachteile mit sich. Sie verursacht grundsätzlich einen zusätzlichen Syntheseaufwand, der sich einerseits in hohen Kosten und andererseits in einer beschränkten Verfügbarkeit markierter Liganden niederschlägt. Der häufig zu beobachtende Affinitätsverlust durch das Einführen großer fluorophorer Gruppen sowie aufwändige Sicherheitsvorkehrungen, die beim Umgang mit Radioliganden zu beachten sind, stellen weitere Einschränkungen dar.

Derartige Nachteile lassen sich vermeiden, wenn im Bindungsexperiment an Stelle des markierten Liganden ein nativer (d.h. nicht markierter) Ligand als Marker eingesetzt wird, der mittels Massenspektrometrie analysiert wird. Wir bezeichnen diese Bindungsassays in Analogie zu Radioligandbindungs­­assays als „MS-Bindungsassays“ (Schema). MS-Bindungsassays sind universell anwendbar und lassen sich prinzipiell auf alle gängigen Typen von Radioligandbindungs­assays, wie Sättigungsexperimente, Kompetitionsexperimente oder kinetische Experimente übertragen. In der Arbeitsgruppe wurden bereits MS-Bindungsassays für Dopamin D1- und D2-Rezeptoren sowie für den GAT1-Subtyp der GABA-Transporter etabliert. An weiteren Testsystemen wird gearbeitet.

Schema: Kompetitives MS-Bindungsassays mit Quantifizierung des Target gebundenen Markers. Auf die Inkubation des Targets mit Marker und Testsubstanz, erfolgt die Abtrennung des Target-Marker-Komplexes mittels Filtration. Nach Freisetzung des gebundenen Markers aus dem Target-Marker-Komplex wird der Marker mittels LC-ESI-MS-MS quantifiziert.

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